了解如何冷凍細胞是從事生物醫(yī)學(xué)研究人員必不可少的知識。研究人員通常會冷凍原代細胞和細胞系，以便靈活安排實驗時間并保持細胞質(zhì)量。冷凍細胞庫可確保檢測結(jié)果的可重復(fù)性，并在細胞培養(yǎng)物受到污染或丟失時提供備用細胞來源。

  冷凍細胞是一個較為復(fù)雜過程，由于水是活細胞中最重要的成分，當(dāng)水結(jié)冰時，細胞代謝就會停止。經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕鈨龀绦蚝螅毎麜謴?fù)正常的生物活動。

  冷凍保存細胞有許多優(yōu)點，但由于細胞暴露在冷凍保護劑中并且冷凍所需的低溫下，該過程可能會給細胞帶來壓力。上海通蔚為大家介紹大多數(shù)細胞冷凍方案。

  選擇正確的冷凍介質(zhì)

  選擇正確的冷凍培養(yǎng)基取決于細胞系和應(yīng)用，并且需要進行優(yōu)化以確保解凍后最高的活力。

  對于大多數(shù)應(yīng)用，應(yīng)該考慮使用生長培養(yǎng)基血清或市售的冷凍培養(yǎng)基，例如二甲基亞砜（DMSO）。在開始細胞冷凍方案之前，請確保您已經(jīng)準備好適合懸浮細胞的溫度和體積的冷凍培養(yǎng)基。

  在進入冷凍程序之前，請記住在與細胞混合后多次上下吹打培養(yǎng)基以確保單細胞懸浮。此外，最好不要將懸浮液倒入低溫小瓶中，因為這將大大增加污染風(fēng)險。

  低溫瓶和標簽

  用于冷凍細胞的任何小瓶都應(yīng)適合低溫應(yīng)用。這些小瓶應(yīng)由聚丙烯制成，可承受低至-196°C的溫度。使用聚酯低溫小瓶和可耐受超低溫的粘合劑為您的小瓶貼上標簽。在粘貼到小瓶之前，請在標簽上打印所有重要信息，例如日期、細胞類型、識別號和濃度。

  細胞冷凍率和長期儲存

  將細胞分裝到貼有適當(dāng)標簽的低溫小瓶中后，即可開始冷凍程序。與解凍細胞不同，冷凍過程是一個緩慢、可控的過程。讓冷凍保護劑有時間從細胞中去除水分至關(guān)重要，這可以降低因冰晶形成而造成損害的風(fēng)險。

  當(dāng)細胞被快速冷凍時，水和離子往往會留在細胞中。這最大限度地減少了溶質(zhì)濃度效應(yīng)和脫水。然而，細胞內(nèi)的冰形成會通過撕裂和刺穿細胞膜造成嚴重損害。相反，如果細胞緩慢冷凍，細胞外的水會在細胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透逸出，但會增加細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，而這可能是有毒的。

  實際上，非常快和非常慢的冷凍速度都會導(dǎo)致過量冰形成或溶質(zhì)毒性增加。DMSO等冷凍保護劑可促進脫水、減少冰結(jié)晶并降低溶質(zhì)效應(yīng)。對于大多數(shù)細胞來說，最佳冷凍速度是每分鐘1°C。正如您在圖表中看到的，在這個溫度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)冰形成的負面影響與溶質(zhì)濃度的增加達到平衡。

  這將使細胞活力達到最大。

  冷凍細胞通常是一個兩步過程，其中細胞以緩慢、可控的速率冷卻至-80°C，然后在-135°C或更低的溫度下長期儲存。

  步驟1：以控制的速率將細胞冷凍至-80°C

  如前所述，必須使用控速冷凍機或控速容器將細胞以每分鐘約-1°C的速率冷卻至-80°C。

  將凍存瓶放入容器后，可將其放入-80°C冰箱中過夜。12小時后，凍存瓶即可轉(zhuǎn)移至液氮冰箱中進行長期保存。

  值得注意的是，應(yīng)避免將細胞在-80°C冰箱中儲存超過兩周。在此溫度下儲存時間過長會導(dǎo)致細胞死亡和樣品活力降低。

  步驟2：在液氮中長期儲存

  液氮儲存方法有兩種基本類型。一種是將小瓶直接浸入液體中。另一種是將小瓶置于液體上方的氣相中。

  氣相系統(tǒng)在容器內(nèi)形成垂直溫度梯度。在底部，液氮將保持約-196°C的溫度。

  氣相溫度在到達容器頂部時會升高。應(yīng)使用足夠的液氮，以確保罐頂部最熱部分的溫度始終低于-135°C。

  我們建議將小瓶儲存在氣相中，而不是液相中。代謝活動在-135°C時停止，而液相的額外低溫并沒有帶來真正的好處。

  事實上，將小瓶浸入液相中存在部分液氮可能滲透并損壞小瓶的風(fēng)險。

  對于從事免疫學(xué)、毒理學(xué)和其他科學(xué)領(lǐng)域的研究人員和實驗室工作人員來說，學(xué)習(xí)如何冷凍細胞并使其在解凍后保持最大活力是一項重要技能。

  總而言之，制定細胞冷凍方案時主要考慮三個因素：冷凍介質(zhì)的類型和濃度、低溫小瓶的類型、最佳冷凍速度和長期儲存溫度。

  最好使用含有冷凍保護劑（如DMSO）的冷凍介質(zhì)來冷凍健康且可存活的細胞。

  冷凍培養(yǎng)基細胞濃度取決于細胞和應(yīng)用，因此需要進行優(yōu)化以實現(xiàn)長期儲存。

  低溫瓶應(yīng)帶有外螺紋，額定溫度為-196°C。

  冷凍細胞時，確保控制冷卻速度為-1°C/min，直至達到-80°C，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐的氣相中進行長期儲存。