聚合酶聯(lián)式反應(yīng)（PCR）是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增特定DNA片斷工具。然而，在實(shí)際工作中有可能無法獲得擴(kuò)增，這樣會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展及效率。以下是通蔚為大家整理了解決PCR擴(kuò)增問題的辦法。

  使用陽性對(duì)照進(jìn)行測(cè)試

  確保PCR系統(tǒng)正常運(yùn)行：使用陽性對(duì)照檢查PCR系統(tǒng)是否正常至關(guān)重要。如果陽性對(duì)照失敗，則可能是試劑或熱循環(huán)儀存在問題。

  污染

  交叉污染：確保您使用的設(shè)備和試劑沒有受到污染。外來的DNA的存在可能會(huì)干擾PCR.

  抑制劑污染：部分樣品可能含有PCR抑制劑，鹽或干擾反應(yīng)試劑。使用適當(dāng)?shù)募兓椒ㄈコ@些抑制劑。

  檢查試劑

  Taq聚合酶質(zhì)量：Taq聚合酶是PCR中關(guān)鍵酶之一。如果這些酶失活或降解，它將無法擴(kuò)增DNA。確保其處于良好的狀態(tài)并已妥善保存。

  緩沖液和dNTP：緩沖液和DNTP（DNA合成所需的核苷酸）必須具有適當(dāng)?shù)臐舛取Ｈ绻鎯?chǔ)不當(dāng)或受到污染，則影響擴(kuò)增。

  調(diào)整熱循環(huán)儀條件

  溫度循環(huán)：如果變性、退火和延伸溫度未得到充分優(yōu)化，則可能無法進(jìn)行擴(kuò)增。確保合適的溫度適合你的實(shí)驗(yàn)條件非常重要的。

  循環(huán)次數(shù)：PCR循環(huán)次數(shù)不足會(huì)阻礙擴(kuò)增，尤其是在DNA濃度較低的情況下，嘗試增加循環(huán)次數(shù)。

  檢查引物

  引物設(shè)計(jì)：如果引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，他們可能無法與目標(biāo)序列結(jié)合。檢查引物特異性和與要擴(kuò)增的DNA序列的互補(bǔ)性。

  交叉條件：退火的溫度對(duì)于引物結(jié)合至關(guān)重要。如果溫度過高或過低，引物將無法正確結(jié)合。檢查引物的最佳條件。

  驗(yàn)證DNA質(zhì)量和濃度

  DNA降解：如果樣本中含有降解的DNA，PCR將無法正常工作。確保DNA完整無損且無污染。在凝膠上進(jìn)行DNA電泳或測(cè)量吸光度260/280通常會(huì)有所幫助。

  DNA濃度：DNA濃度過低會(huì)阻礙擴(kuò)增。使用分光光度計(jì)或定量方法確保DNA濃度正確。

  上述是排查PCR無法擴(kuò)增的幾種辦法，了解這些辦法，不管現(xiàn)在還是未來有助于提高PCR實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展和效率。希望上述內(nèi)容對(duì)您有個(gè)指導(dǎo)作用，如果還有什么疑問，歡迎前來咨詢了解。