在各種ELISA方法中，夾心ELISA因其卓越的敏感性和特異性而被廣泛應用于檢測二價或多價大分子抗原，在免疫學、細胞生物學以及分子生物學研究中扮演著至關重要的角色。夾心ELISA法使用兩種針對不同表位的抗體來捕獲和檢測目標抗原，大大提高了檢測的特異性。第一種抗體包被在酶標板上，用于捕獲目標抗原；第二種抗體則與酶聯(lián)結，用于檢測被捕獲的抗原。為了更詳細地了解夾心ELISA的原理和步驟，請繼續(xù)閱讀下文。

    夾心ELISA法原理

    夾心ELISA，又稱雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定，是一種高特異性和敏感的免疫分析技術，用于檢測體液中可溶性的大分子抗原。其原理是：首先將特異性捕獲抗體包被在酶標板的固相載體表面，并用封閉液封閉未結合的位點。然后加入待測樣本，使樣本中的抗原與捕獲抗體結合。洗滌去除未結合的物質后，加入針對目標抗原不同表位的酶標檢測抗體，使其與已結合的抗原結合。再次洗滌去除未結合的酶標抗體。最后加入酶的底物，酶催化底物反應產(chǎn)生可檢測的信號，如顏色變化或熒光。信號強度與抗原的濃度成正比。通過與預先建立的標準曲線比較，即可定量測定樣本中抗原的濃度。每次加樣后都需要進行洗滌步驟，以減少非特異性結合的干擾。

    夾心ELISA法步驟

    包被抗體。在酶標板（通常是96孔板）的每個孔中加入特定的捕獲抗體，該抗體能特異性結合目標抗原。將孔位在室溫或4℃下孵育一段時間，使抗體牢固吸附到板上。完成之后，使用洗滌液洗去未結合的抗體。

    封閉處理。為了減少非特異性結合，需要將孔中加入封閉劑（如BSA或明膠），覆蓋未結合的表面。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結合的封閉劑。

    樣本加入與孵育。將含有待測抗原的樣本加入到已包被和封閉的孔中。孵育一段時間，使樣本中的抗原與板上的抗原結合。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結合的樣本成分。

    酶標抗體添加。加入針對目標抗原不同表位的、已與酶（如HRP）標記的第二抗體。這個抗體將與第一步固定在板上的抗原結合，形成“夾心”結構。孵育一段時間后，再次洗滌去除未結合的酶標抗體。

    底物與顯色。加入酶的底物，如TMB或ABTS，酶標抗體中的酶會催化底物產(chǎn)生顏色變化。顯色反應在一定時間后終止，通常通過加入酸性溶液來停止反應。

    讀取與分析。使用酶標儀測量每個孔的顏色強度，通常是在特定波長下（如450nm）。根據(jù)標準曲線（由已知濃度的標準樣品生成）計算未知樣本中抗原的濃度。

    上述是夾心ELISA法檢測步驟，理解這些原理和步驟對于成功進行直接ELISA實驗至關重要。夾心ELISA法因其敏感性和特異性廣泛應用在免疫學、細胞生物學以及分子生物學研究中。相較于其他ELISA方法，夾心ELISA操作簡便、使用兩種抗體識別抗原的不同表位，大大提高了檢測的特異性，適用于復雜樣品檢測，這限制了該方法對一些小分子抗原的應用。隨著技術的不斷發(fā)展，更高效、更靈敏的間接ELISA方法將不斷涌現(xiàn)，為生物醫(yī)學研究和臨床診斷提供更強大的工具。